La cloroquina 129

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Supresión de la autofagia por cloroquina sensibiliza 5-fluorouracilo mediada por la muerte celular en células de carcinoma de vesícula biliar Publicada: 03 de marzo 2014 Abstract Autophagy1 es un complejo de respuesta celular adaptativa que aumenta la supervivencia de células de cáncer en la cara de tensiones celulares tales como chemothery. Aquí nos muestran que en el carcinoma de vesícula biliar humana (GBC), líneas de células SGC-996 y GBC-SD, la autofagia es inducida por el agente que daña el ADN de 5-fluorouracilo (5-FU). Mientras que en combinación con el pre-tratamiento de cloroquina (CQ), un inhibidor de la autofagia, la inhibición de 5-FU a la proliferación y viabilidad de las células GBC fue potenciada. Además, 5-FU tratamiento resultó en un aumento general de la tasa de apoptosis y G0 / G1 detención de las células GBC, y el efecto se potenció por CQ pre-tratamiento. Desde el 5 - FU inducida por la autofagia en las células del GBC. y CQ inhibe la autofagia, nuestros hallazgos sugieren un posible mecanismo que inhibe la autofagia inducida CQ-5-FU, que modifica la citotoxicidad del 5-FU. La terapia de combinación de CQ y 5-FU debe ser considerada como una estrategia eficaz para el tratamiento de carcinoma de la vesícula biliar. Introducción Para mejorar las tasas de curación del cáncer, la comprensión de los mecanismos de los agentes contra el cáncer, así como los mecanismos de adquisición de la quimiorresistencia por las células cancerosas, es esencial. El carcinoma de vesícula biliar primaria es una de las enfermedades más comunes del tracto digestivo en China y ha ido en aumento en todo el mundo la incidencia 1. No hay ningún síntoma específico para este tipo de pacientes. En la mayoría de los casos, el diagnóstico de este carcinoma se hace generalmente después de la operación sobre los tumores en una fase avanzada, lo que resulta en una tasa de supervivencia a 5 años del 10 y casi la mitad de los pacientes que ya tienen enfermedad metastásica en el momento de la cirugía 2. 3. Por lo que sabemos, no hay combinaciones de quimioterapia adyuvante ampliamente aceptados para el carcinoma de vesícula biliar primaria debido a su toxicidad, resistencia a los medicamentos y la eficacia limitada. Un enfoque para superar este problema importante puede ser el descubrimiento de nuevas aplicaciones terapéuticas de los medicamentos ya existentes, que se denomina reutilizando 4. CQ, un fármaco antimalaria ampliamente utilizado, se ha utilizado durante seis décadas como su eficacia, precio bajo, de baja toxicidad para el ser humano y bien entendidas propiedades farmacológicas 5. 6. CQ es también una opción para el tratamiento de diversas enfermedades tales como artritis reumatoide, lupus eritematoso y la hepatitis amebiana 7. 8. Más recientemente, se ha dado importancia a la capacidad de CQ para bloquear la autofagia mediante la inhibición de proteasas lisosómicas y eventos de fusión autophagosome-lisosomales 9. Puesto que se cree la autofagia para actuar como un vía de supervivencia celular en el cáncer de 10. 11, CQ se ha estudiado como un agente potencial en la terapia del cáncer. Su particular que se peina CQ con el agente alquilante ciclofosfamida ADN aumentó significativamente la tasa de regresión del tumor y el retraso en la recurrencia del tumor 12. Hasta ahora, CQ y sus derivados son los únicos inhibidores de la autofagia disponibles para el tratamiento clínico de los pacientes. Hay más de veinte ensayos clínicos enumerados en la página web clinicaltrials. gov 13 utilizando CQ o sus derivados para poner a prueba si la inhibición de la autofagia en un entorno clínico puede aumentar la eficacia de las terapias del cáncer 14. La autofagia es una respuesta de supervivencia muy conservadas a la limitación de las condiciones de crecimiento, como el agotamiento de los nutrientes, la hipoxia y la presencia de fármacos citotóxicos 15. 16. Se genéticamente está regulado por una familia de genes relacionados con la autofagia (ATG) y puede ser detectado por la detección basada en anticuerpos molecularmente de gen, proteína asociada a microtúbulos 1 cadena ligera 3 (LC3). LC3 se expresa constitutivamente a niveles bajos en la mayoría de las células, y conjugado con objetivos fosfatidiletanolamina la membrana autophagosomal. La forma conjugada de LC3 se llama LC3-II y considerado como marcador específico de la autofagia 17. Mientras tanto, estudios recientes indican la función de la proteína p62 como una molécula adaptadora que participan en la activación de la autofagia que interactúa con agregados de proteína polyubiquitinated y los objetivos para autofagosomas 18. En el presente estudio, que tuvo como objetivo investigar los efectos de la combinación de quimioterapia con CQ en dos tipos de células de la vesícula biliar-derivadas de carcinoma, a saber SGC-996 y GBC-SD. 5-FU es uno de los principales agentes antitumorales utilizados contra el cáncer durante unos 40 años. Se ejerce sus efectos contra el cáncer a través de la inhibición de la timidilato sintasa y la incorporación de sus metabolitos activos, en el ARN y el ADN con el fin de influir en el metabolismo de uracilo y se ha utilizado en la Fase II de prueba de la quimioterapia de combinación para el cáncer avanzado de la vesícula biliar 19. 20 . Nuestra investigación revela la quimiosensibilizador de CQ en 5-FU puede depender en parte de su capacidad para inhibir la autofagia. Por otra parte, la apoptosis inducida por 5-FU se mejoró después de la inhibición de la autofagia, lo que sugiere una novedosa y prometedora estrategia para aumentar la eficacia clínica de 5-FU para el tratamiento de carcinoma de la vesícula biliar. Materiales y métodos Reactivos y anticuerpos 5-FU, albúmina de suero bovino y CQ (BSA) se adquirieron de Sigma-Aldrich. RPMI-1640, DMEM suero medio y fetal bovino (FBS) eran de Gibco. Los anticuerpos primarios contra LC3, GAPDH eran de Cell Signaling Technology, Inc. anticuerpos primarios contra P62, ATG5, ATG7 eran de Epitomics, Inc. El plásmido GFP-LC3 fue un regalo del laboratorio del Dr. Hong-jin Chuan de la Universidad de Zhejiang, China. Los cultivos de células y transfección de vesícula biliar humana línea celular de carcinoma GBC-SD fue comprado a banco de células (Academia de Ciencias de China). Cada respectivamente, las células SGC-996 o GBC-SD se mantuvo en medio RPMI-1640 o DMEM suplementado con 10 (v / v) de FBS y 1 (v / v) de penicilina / estreptomicina y se incubaron en una atmósfera humidificada 5 incubadora de CO2 a 37ºC. Los plásmidos (GFP-LC3) o pequeños ARN de interferencia (siRNA ATG5 y ATG7) se transfectaron transitoriamente en células con Lipofectamine 2000 transfección o reactivo RNAi MAX de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Invitrogen). Después de 24 horas, las células fueron tratadas con 5-FU o CQ y se sometieron a análisis fluorescente o ensayo de transferencia Western. La línea celular SGC-996 fue proporcionada por el laboratorio del Dr. Ying-Bin Xin Hua Lius al Hospital Afiliado a Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, China. Dos de tratamiento de células humanas GBC FU y CQ se sembraron y cultivaron hasta que alcanzaron aproximadamente 40-50 subconfluencia. Y a continuación, las células se pre-trataron con CQ durante 12 horas, después de lavado con PBS las células se trataron con o sin 5-FU durante 48 h. El tratamiento se lavó y se reemplazó con medio regulares. Desde 100 M CQ mayoría indujo la formación de orgánulos vesiculares ácidos (AVO), mientras que hizo inhibición mínima en las células GBC en 12 horas, en los experimentos subsiguientes, la dosis de CQ se fijó en 100 M, seguido de lavado con PBS y después se trató con 5-FU (5 M) por otro de 24-48 h. Ensayo de citotoxicidad La citotoxicidad de los productos químicos contra las células GBC-SD SGC-996 y se determinó por CCK-8 ensayo. Las células se sembraron en placas de 96 pocillos y se trataron con los productos químicos con diferentes concentraciones. Después de 24 h o 48 h de incubación, 20 l se añadió CCK-8 en cada pocillo de 4 h de incubación. La absorbancia se midió usando un modelo ELx800 Micro lector de placas (Bio-Tek Instruments, Inc.) a 450 nm. La detección de orgánulos vesiculares ácidos (AVO) Las células que sufren la autofagia se desarrollan generalmente, orgánulos vesiculares-dobles membraned ácidas (predominantemente de autofagosomas y autolisosomas), que pueden ser detectados por los tintes específicos. naranja de acridina (AO) es un fluorescente emite luz verde cuando se limita al ADN. mientras que se acumula en los espacios de ácidos y fluorescencia de color rojo brillante. Se reconoce selectivamente autofagosomas y autolisosomas. y la intensidad de la fluorescencia roja es proporcional al grado de acidez, también representa la formación de objetos AVO 21. células GBC-SD SGC-996 y se prepararon y trataron como se describe, y las células se resuspendieron en PBS () y se tiñeron con AO (5 g / ml) durante 15 min a temperatura ambiente. Las células se examinan bajo un microscopio de fluorescencia a 40 de aumento de lente de objetivo. se prepararon de análisis 1 10 5 células mortalidad celular y se trataron como se ha descrito, se recogió por trpsinization, se centrifugaron, se resuspendieron en 500 l de PBS y se tiñeron con azul de tripano 0.5. Las células no teñidas se cuantificaron utilizando una cámara de recuento. detección de la apoptosis se prepararon 1 10 5 células y se trataron como se ha descrito, se recogió por trpsinization, se centrifugaron, se lavó dos veces con 3 ml de PBS, se resuspendieron en 500 l de PBS y se tiñeron con 1 Anexina V-FITC / PI, analizado por FACS calibre (Becton Dickinson) . se prepararon análisis 1 10 5 células del ciclo celular y se tratan como se ha descrito. Después de la privación de suero y el tratamiento de hambre, se recogieron las células, se lavaron una vez con 3 ml de PBS, se centrifugaron, se resuspendieron en 1 ml de PBS y se fijaron con 80 metanol para obtener una concentración final de 70-75. Las células fijadas se almacenaron en un 20C al menos por 12 h. Antes del análisis, las células se lavaron una vez con 3 ml de PBS, se resuspendieron en 250 l de PBS que contenía 1 RNasa y 1 yoduro de propidio. Después de la incubación en la oscuridad durante 30 minutos, las células tratadas se analizaron mediante FACS calibre y los resultados obtenidos se analizaron mediante el software Cell Quest. ensayo de formación de colonias de células SGC-996, suspendidas en un medio de cultivo fresco, se sembraron 500 células / pocillo en 35 mm plato. Se dejó que las células de viabilidad para fijar en 24 horas y se trataron con CQ en 100 M durante 12 horas, se lavaron con PBS, y / o tratados por 5-FU en 5 M durante 48 horas. Luego, las células se lavaron con PBS (), y se alimentaron con medio de cultivo fresco, sin CQ y / o 5-FU, y se dejaron crecer durante 14 días en condiciones de cultivo normales (37ºC, 5 CO 2). Para visualizar las colonias contenían 50 o más células durante los 14 días de cultivo, se eliminó medios de comunicación, las células se fijaron en paraformaldehído al 3,7 por 15 min y se tiñeron con cristal violeta y las colonias se contaron bajo el microscopio de luz. Para cada condición experimental, las colonias se presentaron como el número medio SD de al menos 3 experimentos independientes fueron contados. de aislamiento de proteínas y análisis de transferencias Western Después del tratamiento, las células se lavaron con PBS y se lisaron con tampón RIPA con inhibidores de proteasa. La proteína se cuantificó utilizando ensayo de proteína BCA (Pierce). 1,030 mg de proteína total se resolvieron por electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida, se transfirieron a una membrana de PVDF (Millipore) y luego detectada por los anticuerpos primarios y secundarios adecuados antes de la visualización con un kit de quimioluminiscencia (Pierce). La visualización se realizó con Image Quant LAS-4000 (Fujifilm, Tokio, Japón). Las células microscopía de fluorescencia fueron transfectadas con plásmidos GFP-LC3, seguido de tratamiento como se describe. Después, las células se lavaron rápidamente con PBS y se fijaron a temperatura ambiente durante 15 minutos con 3,7 paraformaldehído. Después de ser lavado con PBS dos veces, los núcleos celulares se tiñeron por DAPI. Las muestras fueron observadas bajo un microscopio de fluorescencia. células de microscopía electrónica de transmisión tratada se lavaron y se fijaron durante 30 min en 2,5 glutaraldehído. La muestra se post-fija en 1,5 terroxide de osmio, se deshidrataron en grados ascendentes de soluciones de etanol (50, 70, 90, 100) y acetona, antes de la incorporación en la resina Araldite. Las secciones finas se prepararon en un ultramicrotomo y se tiñeron con acetato de uranilo y plomo-ácido goji. Todas las secciones fueron examinadas y fotografiadas con un microscopio electrónico Philips 10 Tecnai a 80 kV. El análisis estadístico A menos que se indique lo contrario, los datos se expresan como la media SD y se analizó mediante la prueba t de Student, las diferencias se consideraron significativas cuando el valor de p fue inferior a 0,05. Resultados Efecto de 5-FU y CQ en la actividad proliferativa de las células GBC El ensayo CCK-8 reveló CQ muestran un efecto citotóxico débil a la dosis de 100 M durante 12 horas mientras que la citotoxicidad se incrementó significativamente por 24 h - tratamiento de la misma concentración (archivo adicional 1. Figura S1 A). Por otra parte, 100 M CQ mayoría indujo la formación de objetos AVO igual a la dosis de 200 M (archivo adicional 1. Figura S1B), con una inhibición mínima en células GBC al mismo tiempo. De acuerdo con los resultados anteriores, se seleccionó la concentración de 100 M de CQ en 12 h tratos que muestran ligera inhibición en las células del GBC para los experimentos adicionales. CQ autofagia inducida por 5-FU en las células GBC Con el fin de investigar el efecto de 5 bloqueado - FU en la autofagia, así como el efecto inhibidor de CQ, la expresión de LC3-II y p62 en las células GBC fue investigado por Western blot (adicional 2. presentar la figura S2). Dado que los informes anteriores han demostrado que los efectos antitumorales de 5-FU dependen de duración de la exposición en lugar de los niveles de concentración de plasma de 22, se llevó a cabo el transcurso de tiempo después del tratamiento de células GBC con 5-FU solo. Los resultados revelaron un tiempo que dependen de los cambios de los marcadores de autofagia. incluyendo acumulación de LC3-II y la degradación de p62 (Figura 1 A). Más importante . CQ pretratamiento aumentó notablemente tanto LC3 - los niveles II y proteínas p62. que indica el flujo autophagic mejorada inducida por 5 - FU en las células GBC (Figura 1 C). En consonancia, las características ultraestructurales de las células SGC-996, siguientes 24 h o 48 h de tratamiento con 5-FU (5 M), revelaron cambios morfológicos incluyendo vacuolas autofágicas obvias en el citoplasma en comparación con las células en el estado basal (Figura 1 B) . Por otra parte, la fluorescencia verde mostró principalmente una distribución uniforme en no tratado GFP-LC3 células que expresan SGC-996. Coincidentemente, se han observado algunos puntos verdes en las condiciones de tratamiento de 5-FU y marcan las pautas de GFP-LC3 que representa vacuolas autofágicos se formaron en el citoplasma después de un tratamiento de 5-FU combinado con CQ (Figura 1 D). Estos resultados mostraron que el 5-FU indujo la activación de la autofagia y el proceso de autofagia se produjo dentro de varias horas después del tratamiento con el fármaco. CQ aumentó la expresión de LC - 3 y p62 en las células del GBC después del tratamiento con 5 - FU. (A) Tiempo de detección curso de LC-II y p62 después del tratamiento de células GBC con 5-FU durante 24 horas o 48 h por Western blot. Los paneles inferiores representan los valores densitométricos obtenidos a partir de las bandas de la transferencia de western (p 0,05, n 5, Escala bar 10 m). CQ potenció la supresión del crecimiento en células GBC inducidos por 5-FU Nuestros estudios demostraron que 5-FU inhibe la proliferación de células GBC en maner tiempo y dependiente de la dosis. Mientras tanto, se requiere una sola dosis de 5-FU en 5 M para reducir alrededor de 30 tasa de proliferación en las células GBC según nuestros experimentos y por debajo de la concentración máxima para hacer que la mielotoxicidad. Después de un pre-tratamiento de 100 M CQ durante 12 horas, que tenía casi ningún efecto inhibidor sobre las células GBC, notablemente potenciada sobre 50 reprimir efecto de proliferación de 5 tratamiento M 5-FU durante 48 horas (Figura 2 A). Similar a los resultados de análisis de la mortalidad celular, el crecimiento de células GBC se redujo significativamente por el tratamiento de combinación de CQ y 5-FU, en comparación con el 5-FU o CQ solo (Figura 2 B). Efecto de CQ en 5 - FU - inducido la proliferación celular y la inhibición GBC mortalidad. El efecto de CQ-tratamiento previo sobre el efecto inhibidor de 5-FU en la tasa de actividad y la mortalidad celular proliferativa de SGC-996 células y células GBC-SD fue investigado por CCK-8 y ensayo de tripano tinción de exclusión con azul. El eje y representa la tasa de proliferación / mortalidad, calculado como la relación de control normal (células no tratadas). Los valores se expresan como media SD. (A) Pre-tratamiento de células con CQ en 100 M durante 12 horas antes de la exposición a 5-FU en 5 M de 48 horas, resultó en significativamente la potenciación del efecto inhibitorio (25 vs. 62 inhibición (células SGC-996) y 24 frente a 50 células de inhibición (GBC-SD) de 5-FU solo y CQ 5-FU, respectivamente) (p 0,05 frente al control, n = 5). CQ aumentó la citotoxicidad del 5-FU a través de la inhibición de la autofagia Dado que la autofagia es un mecanismo para promover o retrasar la muerte celular 23, se evaluó si la inhibición de la autofagia contribuyó al aumento de la citotoxicidad del 5-FU cuando se combina con CQ. Por otra parte, también encontramos 3-MA (un inhibidor de la autofagia bien conocido) potenció la supresión del crecimiento de las células del GBC inducida por 5-FU (datos no muestran). Su supuesta la resistencia de las células del GBC a 5-FU puede ser superada con el inhibidor de la autofagia. Dos reguladores clave de la autofagia, ATG5 y ATG7 con ARN corto de interferencia (siRNA) fueron diseñados para examinar la contribución de la autofagia para la supervivencia y la recuperación de las células GBC después del tratamiento de 5-FU. Los niveles de caída logrado para cada expresión de ARNm de genes y proteínas, eran en su mayoría grandes de 80 a 72 horas (Figura 3 A). 24 horas después de la adición de siRNA, las células se trataron con 5 M 5-FU durante 48 horas. Se recogieron las células adherentes, se tiñeron con azul de tripano y se contaron (Figura 3 B). Estos recuentos de células indicaron que desmontables de ATG5 o ATG7 reduce la proliferación y la mortalidad a las 48 h post-tratamiento con 5-FU a una concentración de 5 M. Tomados en conjunto, estos datos sugieren que a medida que el inhibidor específico, CQ enchanced la citotoxicidad de 5-FU mediante la inhibición de la autofagia. CQ aumentó la citotoxicidad del 5 - FU a través de la inhibición de la autofagia. (A) La contribución de la autofagia a las células GBC-SD SGC-996 y después del tratamiento con 5-FU fue examinado por ATG5 y ATG7 con siRNA. La expresión de mRNA de cada gen se redujo significativamente por el tratamiento siRNA (superior), en paralelo con los niveles de proteína después de la transfección (inferior). GAPDH se utilizó como control de carga. las células (B) GBC transitoriamente transfectadas con ARNsi de control negativo, Atg-5 o Atg-7 siRNA se trataron con 5 M 5-FU durante 48 horas. La proliferación celular y las tasas de mortalidad fueron medidos por CCK-8 y el ensayo de tinción de exclusión con azul de tripano (p 0,05 frente al control, n 3). CQ aumento de la apoptosis y potenció la detención G0 / G1 de las células GBC inducidos por 5-FU en aclarar si el efecto inhibidor de 5-FU combina con CQ en células GBC era debido a la apoptosis y / o la detención del crecimiento celular, citometría de flujo y la formación de colonias se han usado ensayo. CQ pre-tratamiento dio como resultado el aumento del porcentaje de células apoptóticas seguido de 5-FU tratamiento (34,3 en comparación con 46,2 para los tratados con 5-FU solo y CQ 5-FU en las células GBC-SD, 23,4 en comparación con 48,6 para el 5-FU solo y CQ 5-FU en las células SGC-996, respectivamente) (Figura 4 a). Consistentemente. el nivel de producto escindido de las caspasas Restar poli ADP - ribosa Polyermerase (PARP) se correlacionó con la activación de caspasas (Figura 4 B). CQ potencia la apoptosis de las células SGC inducidos por 5 - FU. (A) La población de células apoptóticas anexina V fueron evaluados por FCM usando anexina V-FITC / PI tinción en SGC-996 células y células GBC-SD después de CQ-pretratamiento a 100 M durante 12 horas, seguido de 5-FU a 5 M durante 48 horas. El porcentaje de células apoptóticas con anexina V aumentado por el pretratamiento con CQ seguido por 5-FU. Los valores se expresan como media SD. (B) las células se trataron con GBC CQ en 100 M durante 12 horas, se lavaron con PBS, y / o tratados por 5-FU en 5 M durante 48 horas, respectivamente. GAPDH se utilizó como control interno. La escisión de PARP inducida por 5-FU y CQ en células GBC se examinó con análisis de transferencia de Western. Los valores de la intensidad de la banda por debajo de la figura representan la estimación densitométrico de cada banda normalizado por GAPDH. Los experimentos se repitieron tres veces con resultados reproducibles. Por otra parte, el tratamiento previo con CQ resultó en incremento del porcentaje de células GBC en la fase G0 / G1. en comparación con las células tratadas con 5-FU solo (52,7 en comparación con 74,6 para 5-FU solo y CQ 5-FU en las células SGC-996, 61,6 en comparación con 76,8 para los tratados con 5-FU solo y CQ 5-FU en GBC - células SD, respectivamente) (Figura 5 A). La viabilidad de las células GBC después del tratamiento con 5-FU y / o CQ se evaluó por el ensayo de formación de colonias. Las células se pre-trata con o sin CQ durante 12 horas seguido de tratamiento con 5-FU durante 48 horas, y luego se alimentó con medio de cultivo completo fresco durante 2 semanas. tratamiento individual de 5-FU o CQ provocó un retraso y una ligera inhibición de la formación de colonias, mientras que el tratamiento previo de las células con CQ en 100 M durante 12 horas antes de la 5-FU formación de colonias redujo significativamente (Figura 5 B). CQ inhibió la formación de colonias de células GBC en combinación con 5 - FU. (A) El análisis de los cambios en el ciclo celular se cuantificó por citometría de flujo después de tinción PI en SGC-996 células y células GBC-SD tratadas sin o con 5-FU durante 48 h después de 12 horas de pre-tratamiento sin o con CQ. Los valores se expresan como media SD. El tratamiento de células GBC con 5-FU solo resultó en un incremento de detención intra-S, pero la detención G1 se potenció por CQ-pretratamiento. Mientras tanto, G2 / M progresión de las células GBC fue bloqueado por el tratamiento con 5-FU solo, y se potenció por el 12 horas de tratamiento previo de CQ. (B) Se utilizó el ensayo de formación de colonias para evaluar las células tratadas GBC recuperación sin o con 5-FU durante 48 h después de 12 h de pretratamiento sin o con CQ (100 M). Los valores se expresan como media SD. Un solo tratamiento de 5-FU o CQ como resultado un retraso y una ligera inhibición de la capacidad de formación de colonias, en el día 13 de la cultura mayoría de las células eran recuperación y se había formado colonias. Sin embargo, el tratamiento previo de las células con CQ antes de la exposición a 5-FU resultó en un efecto inhibidor mejorado sobre la capacidad de formación de colonias, que era la recuperación más baja que 50 de las células no tratadas de control en el día 13 (, p 0,05 frente a control, n 3 ). A nuestro leal saber y entender, es el primer informe para demostrar la aplicabilidad potencial de CQ para mejorar la citotoxicidad del 5-FU en células GBC-SGC-996 SD y. El objetivo de la investigación es investigar el efecto de 5-FU en células de carcinoma de vesícula biliar humanos por CQ, el agente lysosomotropic bien conocido y el inhibidor de la autofagia. Dado que los estudios anteriores han demostrado que CQ hace efectos citotóxicos a ciertas células de cáncer de 24. 25, se determinó la dosis de CQ para inhibir la mayoría de la autofagia sin un efecto citotóxico directo sobre las células GBC. Estudios previos han indicado que el efecto biológico de CQ es dependiente de la concentración. Cuando la concentración creciente, CQ inhibe el crecimiento celular e induce la vacuolización con compartimentos ácidos. En concentraciones más altas, o durante períodos más largos, CQ induce directamente la apoptosis y la necrosis. En este estudio, CQ mostró un efecto citotóxico débil a la dosis de 100 M durante 12 horas, la tasa de proliferación en tales condiciones es de aproximadamente 95 en comparación con el control normal. Por lo tanto, la dosis se utilizó para esta investigación no tuvo un efecto citotóxico directo sobre las células del GBC. Entre los agentes quimioterapéuticos utilizados contra el cáncer. 5 - FU sigue siendo la popular. Los mecanismos moleculares de 5 - Fu - activación de la autofagia inducida son complicadas. En células de cáncer de colon. autofagia participa en la respuesta a 5 - FU a través de la regulación de Bcl - xL proteínas 26, parece haber un vínculo entre la autofagia y las vías de la apoptosis. Por otra parte . p53 - AMPK - mTOR puede participar en 5 - FU - respuesta de la autofagia inducida así 27. Aquí hemos demostrado que el tratamiento combinatorio de CQ y 5-FU tenía una mejor eficacia en la eliminación de células GBC. A diferencia de otros inhibidores de la autofagia, CQ inhibir la autofagia en el momento de autofagosomas ya se han formado, se observó CQ acumulado objetos AVO en un maner dependiente de la concentración. Además, la expresión de LC3-II es tiempo y así dependiente de la dosis, que fue en paralelo con los resultados de objetos AVO, indicando CQ bloqueó la degradación de vesículas autofágicas y por lo tanto la realización de la autofagia. El tratamiento de las células con GBC combinación de CQ y 5-FU resultó en la potenciación del efecto inhibitorio sobre la proliferación, la viabilidad y el aumento de la tasa de apoptosis también. El ensayo de formación de colonias se llevó a cabo para evaluar la distinción morfológicamente entre las células tratadas con CQ y / o 5-FU, un solo tratamiento de 5-FU o CQ solo dio lugar a un retraso y parcialmente la inhibición de la capacidad de formación de colonias, sugieren que la autofagia es un mecanismo necesario para la supervivencia celular en tales condiciones, y como resultado las células GBC a un estado de reposo temporal que probablemente depende de la detención de células de la fase G0 / G1. Mientras que la combinación de CQ pre-tratamiento y 5-FU inhibe significativamente la capacidad de formación de colonias de células GBC, y no fue restaurar después de 13 días en cultivo normal. Nuestros resultados son consistentes con otros informes que la inhibición de la autofagia por CQ u otro inhibidor de la autofagia (por ejemplo ATG-5 siRNA y ATG-7 siRNA) induce la muerte celular en tipos de células de cáncer de 28 34. El tratamiento de las células del GBC con 5-FU da como resultado el aumento de LC3-II y disminución de la expresión de p62 en comparación con las células no tratadas de control, que era dependiente del tiempo. Si bien su convencidos de que la autofagia puede ser inhibida por CQ, la hipótesis de que las células inducidas GBC autofagia como el mecanismo de defensa contra 5-FU, y la inhibición de la autofagia tratado por CQ podría ser responsable de la potenciación de la citotoxicidad del 5-FU. Los siRNAs específicos para ATG5 humana y ATG7 se utilizaron para bloquear la autofagia en un paso proximal como ATG son esenciales para la formación de la Atg-Atg12 complejo para activar la autofagia. Se examinaron las tasas de proliferación y de mortalidad de las células GBC tratados con siRNA y / o 5-FU, los resultados de ensayos desmontables siRNA mediada revelaron una falta de la capacidad de la autofagia puede mejorar significativamente la eficacia de 5-FU en las células GBC y proporcionado una oportunidad para el carcinoma de vesícula biliar humana. Recientemente . autofagia se ha demostrado que desempeñan un papel como auto - mecanismo de defensa en la promoción de la resistencia de células tumorales a la quimioterapia. Howerver. el mecanismo sigue siendo objeto de debate. En este estudio . hemos demostrado que la autofagia puede contribuir a la quimio-resistencia en las células del GBC. desde pre - tratamiento de CQ aumentó el 5 - FU - apoptosis inducida y la detención G0 / G1 in vitro. La relación entre la autofagia y la apoptosis es bastante complicado. En algunos casos no tenían ninguna conexión 35. 36, mientras que algunos informe demostró la autofagia podría promover o incluso impedir la apoptosis 37. 38. A nivel molecular. la interacción entre ellos se manifiesta por numerosos genes incluyendo ATG5. la Bcl - 2 familia. p53. ARF. DAPK. y E2F1 39 42. La diafonía entre la apoptosis y la autofagia es un factor clave en la evolución del cáncer 42 mientras que las células tumorales cómo autofagia ayuda a resistir a la apoptosis sigue siendo mal definidos. Similar . también se observó la inhibición de la autofagia enchanced 5 - FU - el crecimiento celular inducida. Desde pre - tratamiento con CQ resultó en un incremento de la proporción de células GBC en la fase G0 / G1 en nuestro presente estudio. es posible que el ciclo celular influye en la degradación de la autofagia. y la inhibición de la autofagia puede dar lugar a células de ser detenido a la fase G0 / G1 - fase. Aunque el mecanismo exacto para la inhibición de la autofagia aumentar la citotoxicidad del 5 - FU en las células del GBC merecido ser verificada. En resumen, aquí se reporta, por primera vez, que el 5-FU citotoxicidad inducida puede ser potenciada por CQ pretratamiento. Puesto que hemos demostrado que el bloqueo de la autofagia por factores genéticos (ATG5 siRNA y ATG7 siRNA) o farmacológico (CQ) significa induce la muerte celular en las células del GBC cultivadas con 5-FU, es posible que la autofagia juega un papel protector en la proteasoma la muerte celular inducida por los inhibidores de eliminación citotóxico componente celular, puede ser un factor resistente que disminuye el efecto terapéutico en las dos sensibilidades y, resistente de carcinoma de la vesícula biliar. Por tanto, proponemos que el bloqueo de la autofagia al mismo tiempo puede superar la resistencia de las células del GBC a la muerte celular inducida por 5-FU. estudiar más a fondo, por ejemplo, en el ensayo pre-clínico utilizando modelos animales de carcinoma de la vesícula biliar se requiere para probar la eficacia y la eficiencia de CQ y 5-FU en vivo. Notas Xiao Liang, de JiaCheng Tang contribuyeron igualmente a este trabajo. Declaraciones Agradecimientos Los autores agradecen al Dr. Ying-Bin Liu Xin Hua Hospital Afiliado a Shanghai Jiao Tong University School of Medicine y el Dr. Hong-Jin Chuan de la Universidad de Zhejiang por su ayuda durante el experimento. Este trabajo fue apoyado por las subvenciones de la Oficina de Salud de la provincia de Zhejiang (No.2011KYA087), Zhejiang Provincial Fundación de Ciencias Naturales de China (Nº LY13H180001), Oficina de Educación de la provincia de Zhejiang (N20130416) y los Fondos de Investigación Fundamental para las Universidades Central ( No.2013FZA7015). material complementario electrónico 135782013142MOESM1ESM. jpeg archivo adicional 1: Figura S1: Efecto de CQ y 5-FU en la actividad proliferativa de las células y el crecimiento del GBC. (A) La proliferación celular y la actividad de crecimiento de las células tratadas con CQ SGC-996 y las células GBC-SD durante 12 y 24 horas se evaluaron mediante el ensayo de CCK-8 y la tinción de exclusión con azul de tripano. El eje y representa la tasa de proliferación o viabilidad, calculado como la relación de control normal (células no tratadas). tratamiento CQ en 100 M durante 24 horas resultó en una inhibición significativa de la actividad proliferativa de SGC-996 células y células GBC-SD en comparación con el tratamiento de 12 horas. pero no a dosis más bajas (0,05, p, n 3). (C) CQ indujo la formación de objetos AVO de células GBC. se obtuvo la formación de objetos AVO (proporcional a la intensidad de la mancha roja) con el examen microscópico de fluorescencia, confirmando la autofagia inducida por variar las dosis de CQ (0, 10, 50, 100, 200 M). (JPEG 423 KB) 135782013142MOESM2ESM. jpeg archivo adicional 2: Figura S2: El tratamiento inanición aumentó la expresión de LC-3 en las células del GBC. células GBC se cultivaron en solución salina equilibrada de Earls (EBSS Gibco 14155063) durante 3 horas para activar la autofagia inanición inducida. Los lisados ​​se prepararon y analizaron luego por inmunotransferencia usando anticuerpos contra diversas proteínas. GAPDH se utilizó como control de carga y ambos LC3-II / LC3-I y LC-3II / GAPDH proporciones densitométricos fueron marcados. (P 0,05 frente al control, n 3). (JPEG 60 KB) Autores originales enviadas archivos de imágenes A continuación se presentan los enlaces a los autores originales presentaron los archivos de imágenes. Laboratorio Clave de Cirugía de la provincia de Zhejiang, Sir Run Run Shaw el Hospital de la Universidad de Zhejiang Referencias Wistuba II, Gazdar AF: cáncer de la vesícula biliar: lecciones de un tumor poco frecuente. Nat Rev Cancer. 2004, 4: 695-706. 10.1038 / nrc1429 Ver artículo en PubMed Chen Y, Chen Y, Yu G, H Ding: lymphangiogenic y la densidad de microvasos angiogentic en el carcinoma de vesícula biliar. Hepatogastroenterología. 2011, 58: 20-25. 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